Western blotting实验步骤

1．蛋白质的样品制备：

取心肌组织50mg，待组织块自行溶解，用滤纸吸去其表面水分，将组织块放入玻璃匀浆器球状部位，用组织剪尽量将其剪碎，将剪碎的心肌组织放入玻璃匀浆器的杆状部，按1mlRIPA+10ulPMSF/100mg心肌组织的比例加入RIPA和PMSF（先加RIPA再加PMSF），将玻璃匀浆器插入冰中，匀浆约30分钟。

将心肌组织匀浆转移到离心管中，4℃12000g离心5分钟，收集上清（如有粘稠物进一步用超声处理），样品分装冻存于-20℃备用。

2 .测定蛋白浓度：

2.1 按50：1配置BCA工作液。

2.2 10ulC液（蛋白标准）+90ulPBS液稀释成0.5mg/ml的蛋白标准液。

2.3 分别以0、1、2、4、8、12、16、20ul将蛋白标准液加入96孔板的第1~8标准孔中，在其他样品孔中加入10ul待测样品。

2.4 分别加PBS定容至20ul。

2.5 各孔中加入200ulBCA工作液，室温放置2小时。

2.6 用酶标仪测定蛋白浓度：测定A562，依标准曲线算出蛋白浓度。

3  SDS-PAGE电泳：

3.1 制 胶: 按比例配制分离胶，缓缓地摇动溶液，使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水，以阻止氧气进入凝胶溶液中，静置40min。同前按比例配制浓缩胶，但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，连续平稳的注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，静制60min以上以保证*聚合。

3.2 预电泳： 将聚合好的凝胶安置于电泳槽中，小心拔去梳子，加入电泳缓冲液后低电压10-20V的预电泳20-30min。（目的是清除凝胶内的杂质， 疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通）。

3.3 样品准备：首先计算上样体积，然后按样品：上样buffer=4：1的比例加入上样bufer混匀，沸水煮10分钟，冰上5分钟。

3.4 加 样： 预电泳后依次加入标准品（Marker）和待分析样品。（加样时间要尽量短，以免样品扩散，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液避免边缘效应。每个泳道加5ul。

3.5 电 泳： 加样完毕，选择80V恒压进行电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿到达两胶交界处（一般约20分钟），更换至100V恒压电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳（一般约为1小时20分钟）。

4．转 膜：

4.1 切胶：将电泳完毕的胶完整的放在盛有电转液的玻璃皿中，将目的蛋白所在区域切下来，测量其长宽，并记录。

4.2 剪膜和滤纸：按胶的尺寸剪膜和滤纸（滤纸长宽较凝胶小0.5~1mm，PVDF膜长宽较凝胶大0.5~1mm），滤纸浸入盛有电转液的玻璃皿中10秒钟，膜放入盛有10%甲醇的玻璃皿中10秒钟，然后将两者都放入盛有去离子水的玻璃皿中3分钟，进一步放入盛有电转液的玻璃皿中3分钟。

4.3 向电转槽中倒入部分电转液，将海绵浸入。按如下顺序制作“三明治”（注意避免两边滤纸相互接触，以免发生短路）。从正极到负极按如下顺序排列：正极-海绵-双层滤纸-PVDF膜-凝胶-双层滤纸-海绵-负极。（其中不能留有气泡）卡紧转膜板，电转槽中倒满电转液，将转膜板浸入电转槽中，注意正负极要正确。插上电源，设定恒流20mA转膜，4℃冰箱中。

5、膜的封闭: 用TBST液洗涤印迹膜10分钟x2次。放入5%脱脂奶粉封闭液内，摇床震动，70转/分钟，室温封闭1小时30分钟。

6、一抗孵育：

6.1 配制一抗：按相应抗体的效价加入一抗稀释液，一抗稀释液按0.05% TBST（ml）：脱脂奶粉（g）=20：1配制。

6.2一抗孵育：将封闭后的膜放入杂交袋中，加入一抗约1ml，室温摇床（70转/分钟）孵育1小时30分钟。

6.3 用TBST洗涤膜10分钟x3次。

7、二抗孵育：

7.1 配制二抗：按相应抗体的效价加入二抗稀释液，二抗稀释液按0.05%TBST（ml）：脱脂奶粉（g）=20：1配制。

7.2 二抗孵育：将一抗孵育后的膜放入二抗中，室温摇床（70转/分钟）孵育1小时30分钟。

7.3 用TBST洗涤膜10分钟x3次。

8、ECL显色

8.1 配制ECL工作液：在避光的容器中按A液：B液=1：1的比例配制。

8.2 按膜：工作液=10cm2：1ml的比例将ECL工作液覆盖到膜表面，放置1~2分钟后在凝胶成像系统中观察、拍照。

我们的实验过程如下：

 电泳： SDS-PAGE; 预电泳 恒压55 V 20 min，上样25 ul, 恒压55 V 40 min左右，当样品至分离胶面时，恒压75 V，到考马斯亮蓝至底部，停止电泳。

转印：制作转印三明治，150 mA。8%-90 min,10%-80min,12%-50min。中止转印,有条件可以利用丽春红检测总蛋白转印是否成功。

封闭：将转印膜取出，用去离子水清洗，TBST洗一次5 Min后，加入5%的脱脂牛奶封闭，于28度封闭2小时。(注意封闭液，一抗稀释液，二抗稀释液均含有脱脂牛奶，可以配成含0.01%硫柳汞的溶液以免牛奶变质)

 洗膜1次，10 min，

 一抗孵育：一抗浓度1：100（2.5%牛奶抗体稀释液），4度孵育隔天

 洗膜4次，每次15 min

 二抗孵育：二抗浓度1：3000（2.5%牛奶抗体稀释液），28度孵育1.5-2 H

 洗膜4次，每次15 min（建议洗膜完毕后，不要立刻显色，静置或者轻摇1.5h-2h后再显色）

显色：注意显色时间的控制和曝光时间的控制

祝您工作顺利，实验顺利！